关于结核分枝杆菌检测的论文

结核菌素试验结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应的一种试验。1.结核菌素试剂以往用旧结核菌素（old tuberculin，OT）。系将结核分枝杆菌接种于甘油肉汤培养基，培养4～8周后加热浓缩过滤制成。稀释2 000倍，每含5单位。目前都用纯蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）。PPD有二种：人结核分枝杆菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD。每含5单位。2.试验方法与意义常规试验分别取2种PPD 5个单位注射两前臂皮内，48～72h后红肿硬结超过5mm者为阳性，≥15mm为强阳性，对临床诊断有意义。若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反之，BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介苗接种所致。阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌，但应考虑以下情况：①感染初期，因结核分枝杆菌感染后需4周以上才能出现超敏反应；②老年人；③严重结核患者或正患有其他传染病，如麻疹导致的细胞免疫低下；④获得性细胞免疫低下，如艾滋病或肿瘤等用过免疫抑制剂者。为排除假阴性，国内有的单位加用无菌植物血凝素（PHA）针剂，含10μg作皮试。若24h红肿大于PHA皮丘者为细胞免疫正常，若无反应或反应不超过PHA皮丘者为免疫低下。结核菌γ干扰素释放试验细胞免疫介导的结核菌γ干扰素释放试验（T-cell interferon gamma release assays，TIGRA，又称IFNGRA或GRA）是近年来采用酶联免疫吸附测定（ELISA）或酶联免疫斑点（ELISPOT）法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原的IFN-γ检测释放反应，用于结核菌潜伏感染的诊断。IFN-γ为Thl细胞分泌的一种细胞因子，不但能够反映机体结核的Thl细胞免疫情况，还与体内结核菌的抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再遇到同类抗原时能产生高水平的IFN-γ，因此被用于结核潜伏感染的诊断。目前美国FDA已批准的基于ELISA的QuantiFERON-TB（GIT-G）和欧洲使用的基于ELISPOT的，都是以早期分泌性抗原靶-6（ESAT-6）和培养滤液蛋白-10（CFP-10）为抗原的。其中，QFT-G又出现了一种用试管的改良方法，称为QFT-GIT（QFT-inTube）。ESAT-6和CFP-10都是从短期培养的滤液中分离的低分子量蛋白质，具有良好的免疫原性，而且它们是选自结核分枝杆菌基因组差异区1（region of difference，RD1）基因编码的结核杆菌特异性蛋白。某些TIGRA试验除了上述2种抗原外，还常用抗原。是结核分枝杆菌基因组差异区13（RDl3）基因编码的结核杆菌特异性抗原。这3种抗原在BCG和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失（除外堪萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌和苏加分枝杆菌），因此避免了与卡介苗和大多数非结核分枝杆菌抗原的交叉反应。TIGRA的敏感性和特异性都强于TsT，特别是在HIV感染者、自身免疫性疾病、老人和幼儿等免疫力低下人群的检测中。全球有约1300万人共同感染了HIV和结核杆菌。感染HIV的LTBI由于免疫缺陷，更容易从潜伏感染发展为活动性肺结核。Jiang等对BCG计划接种区域的100个HIV共感染患者用检测，结果显示对于有过BCG接种历史的HIV共感染的LTBI检测比TsT更敏感快速，而且特异性高。Balcells等发现，QFT-G比TST在诊断HIV的LTBI时更少受免疫抑制的影响。Stephan等发现，QFT-G和在检测HIV患者的LTBI时比TST更敏感。QFT-G和的协同性很差，对于不同CD4细胞数量的患者有不同的结果。Aichelburg等发现，QFTGIT可以用于HIV-1感染者的活动性肺结核检测。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种促炎细胞因子，在多种自身免疫性疾病中起重要的病理作用。但是，抗TNF-α的治疗会导致潜伏性肺结核转变为活动性肺结核，而自身免疫性疾病患者由于免疫抑制。TST容易产生假阴性。研究显示，QFT-G和在免疫介导炎症疾病（IMID）患者中检测LTBI的敏感性和特异性都比TST高。终末期肾病（ESRD）患者感染结核分枝杆菌的几率比健康人高10～倍。Lee等比较了QFT-G、和TsT在ESRD患者中LTBI的诊断，结果显示QFT-G和的结果较类似，但TsT和QFT-G、的实验结果相差较远。的检出率比QFT-G高（分别为和）。然而，也有研究显示QFT-G由于有许多不确定性结果，因此不能用于类风湿性关节炎LTBI的检测。Bergamini等应用QFT-G、QFT-GIT和技术对496个0-19岁的儿童和青少年LTBI进行检测，结果发现2种QFT检测得出的结果更相似，QFT相对于在4岁以下儿童中得到的非确定性结果更多。Chun等研究显示，QFT-GIT比TsT在诊断接种过BCG的儿童中LTBI的特异性更强。上述研究表明，TIGRA在HIV共感染、自身免疫性疾病和免疫力低下的儿童中，对LTBI的检出率更高。但是，TIGRA存在无法区分活动期和潜伏期结核、需要抽血获取淋巴细胞、要求专业的操作人员和具备相应条件的实验室、样品必须在采集后8h内完成等缺点，现阶段仍未能完全取代TsT。另外，现阶段研究的样本都非常小，也没有诊断LTBI的金标准。因此，对于TIGRA还有待进一步研究。微生物学检查法结核病的症状和体征往往不典型，虽可借助X线摄片诊断，但确诊仍有赖于细菌学检查。标本标本的选择根据感染部位。可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞。直接涂片镜检标本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法。为加强染色，可用IK（intensified Kinyoun）法染色。将石炭酸复红染色过夜，用盐酸乙醇脱色30s，则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性，也可用金胺染色，在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈显金黄色荧光。浓缩集菌先集菌后检查，可提高检出率。培养与动物试验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH（痰和碱的比例为1:4，尿、支气管灌洗液和碱的比例为1:1）处理15min，时间过长易使结核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各于锥形量筒内静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一步作培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀。分离培养将经中和集菌材料接种于固体培养基，器皿口加橡皮塞于37℃培养，每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2～4周长成肉眼可见的落菌。液体培养可将集菌材料滴加于含血清的培养液，则可于1～2周在管底见有颗粒生长。取沉淀物作涂片，能快速获得结果，并可进一步作生化、药敏等测定和区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。国内学者已证明结核分枝杆菌L型可存在于血细胞内或粘附于细胞表面。这种患者往往血沉加快，用低渗盐水溶血后立即接种高渗结核分枝杆菌L型培养基能提高培养阳性率。动物试验将集菌后的材料注射于豚鼠腹股沟皮下，3～4周后若局部淋巴结肿大，结核菌素试验阳转，即可进行解剖。观察肺、肝、淋巴结等器官有无结核病变，并作形态、培养等检查。若6～8周仍不见发病，也应进行解剖检查。快速诊断一般涂片检查菌数需5x103～4/ml，培养需1x102/ml，标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果，且培养需时较长。目前已将多聚酶链反应（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得阳性，且1-2d得出结果。操作中需注意实验器材的污染问题，以免出现假阳性。又细菌L型由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA，以致造成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，则可出现阳性。目前有条件的单位使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基，测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌，5～7d就可出报告。近年来国内外研究证明临床各种类型的肺结核患者中40% 左右分离出L型。经治疗的结核病人细菌型消失，L型常持续存在。有空洞患者痰中已不排细菌型者，8% 左右仍可检出L型。故有学者建议将多次检出L型亦作为结核病活动判断标准之一，细菌型与L型均转阴才能作为痰阴性。

网上很多题目，都不是原创，最好别用。之前也是网上down的一篇，老师直接说不行。还是后来学长给的雅文网，写的《大肠杆菌检验方法的探究与分析》，十分专业。看下参考文献吧 [1] 毕玲玲1,孙成春2,公衍文3,张欣悦1,安小通1. 黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌临床分布和耐药表型分析[J]. 军医进修学院学报. [2] 熊燕,张虹,陈炎添,容永璋. 社区和医院获得性血流感染的病原菌分布及感染途径调查[J]. 检验医学. 2014(10) [3] 于霞,尚媛媛,赵立平,董玲玲,马异峰,王晓波,黄海荣. 分子杂交法快速鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步评价[J]. 检验医学. 2014(10) [4] 张景皓,王家路,赵虎. 新疆汉族与维吾尔族HBV耐药变异类型与基因型研究[J]. 检验医学. 2014(10) [5] 张津萍,尤永燕,沙仲,张瑞丽,王千秋. FQ-PCR与血清型特异性抗体法检测HSV-2的临床意义[J]. 检验医学. 2014(10) [6] 赵付菊,赵虎. 染色体介导AmpC β-内酰胺酶表达的分子调控机制的研究进展[J]. 检验医学. 2014(10) [7] 乔昀,赵英妹,仲俊,张珏,龚捷文. 实时荧光定量PCR在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的评价与应用[J]. 检验医学. 2014(07) [8] 刘锦燕,倪培华,史册,魏冰,项明洁. 白念珠菌14-α脱甲基酶K143Q氨基酸置换与氟康唑耐药形成的相关性研究[J]. 检验医学. 2014(07) [9] 张勇,刘爱胜,文艳. 75株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌ERIC-PCR菌种分型及其主要耐药机制研究[J]. 检验医学. 2014(07) [10] 胡海燕,裘先前,许照美. 1株与福氏志贺菌Y变种交叉凝集的摩根摩根菌鉴定结果[J]. 浙江预防医学. 2014(10)

结核杆菌的检测方法论文

结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊;动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要.近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交.该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来已较少应用.上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势.近几年兴起的PCR方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室.应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性.PCR方法的另外几个关键因素是:①DNA提取，即对有限的结核杆菌应尽量地将其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR产物的检测方法，即将PCR产物进行快速、灵敏、安全、准确的检测.一、结核杆菌DNA的提取在该技术上，目前仍无一种统一常规化的方法.现有各方法都存在着提取DNA不足的缺点，因此，敏感性受到影响.现在主要的细菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性剂法;②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法;③反复冻融法;④超声波法;⑤溶菌酶加表面活性剂法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.有的学者将硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有机相的界面更牢固，这样不但能减少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的DNA，该二氧化硅用70%乙醇洗涤，而后干燥，最后用双蒸水洗脱(55℃).有报道认为该方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的学者发现未预裂解的结核杆菌直接煮沸进行PCR的效果与预先处理的相仿，提示结核杆菌不预裂解也可直接进PCR.但加入的菌数应<约1000个，否则细菌蛋白会对PCR产生抑制作用.二、引物的设计根据不同型结核杆菌的序列，目前常在下列几种序列内进行引物设计.(一)编码结核杆菌抗原的基因序列1.编码65-KDa蛋白抗原的基因序列:结核杆菌65-KDa蛋白抗原为存在于所有分枝杆菌细胞壁中的热休克蛋白，也是一种交叉反应蛋白.所以依据该序列设计合成的引物，PCR能扩增出所有分枝杆菌的靶DNA片段，没有属内特异性.这种PCR较适用于结核病高发区大规模筛选和流行病普查.另外，对65-KDa蛋白基因的PCR扩增产物进行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准确地检测出结核杆菌的属内归属.2.编码MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白为结核杆菌复合群(MTBC，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)所特有.根据该蛋白的基因序列设计的引物进行PCR，对MTBC模板DNA显示出高的特异性.3.编码38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:该序列仅存在于人型和牛型结核杆菌.采用在此基因内设计合成的引物和探针进行PCR，只能扩增人型和牛型结杆菌的DNA序列，能检出少至10个结核杆菌的纯化.编码32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝杆菌的一种分泌蛋白，由它的基因序列设计的引物和探针进行PCR，可以特异地检测出分枝杆菌的DNA片段，能检测出50fg的纯化DNA，相当于10个结核杆菌.5.编码MPB70抗原的基因序列:MPB70为牛型结核杆菌所特有，由该基因序列设计的引物进行PCR，对牛型结核杆菌的检测具有高度的特异性和敏感性.(二)结核杆菌基因组重复序列1.克隆DNA序列:目前所应用的DNA序列都是MTBC所特有，拷贝数在10个以上，包括亚克隆重组质粒pPH7301和克隆质粒PMTb4，分别含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根据这些基因序列设计的引物，其检出限在20个结核杆菌以下.2.插入序列:结核杆菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它们仅见于MTBC.这两种插入序列在基因组中的拷贝数为1--20个，选择插入序列作为扩增的靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性.尤其是IS6110，是目前进行临床PCR检测的首选区段.(三)人型结核杆菌特异序列mtp40是人型结核杆菌特异性DNA片段，Portillo等选择mtp40作为靶序列，用PCR检测结核杆菌，结果只能扩增人型结核杆菌DNA，敏感性达到10fg纯化DNA量.(四)分枝杆菌dnaJ基因该基因为分枝杆菌共有，但种间又存在差别，在该基因序列内设计合成的引物和探针用于PCR检测，能检出50fg的纯化分枝杆菌DNA，相当于10个结核杆菌.并可用于区分结核杆菌和非典型结核杆菌的鉴别诊断.(五)rRNA序列用“通用”引物在逆转录酶作用下，将16SRNA逆转录合成cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增，检出限达化的结核杆菌rRNA.临床标本中少至10个结核杆菌亦可被检出，该方法由于加了一步反转录过程相对增加了难度，临床一般少用.三、PCR产物的检测方法通常PCR产物的检测方法是经琼脂糖电泳后，用溴化乙锭染色，然后在紫外灯下观察或进一步采用标记的DNA探针杂交.为了进一步提高检测的灵敏度，现多在引物和探针的标记上进行改进.由于放射性标记物的危害性，现多采用非放射性标记，如生物素、荧光素、酶及化学发光剂.Wilson等在巢式PCR的内侧引物上分别掺入生物素和地高辛配基，这样PCR产物两端就分别带有生物素和地高辛配基.PCR产物上的生物素和附着在微型滴定板表面的生物素蛋白结合，使PCR产物附着在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基碱性磷酸脂酶结合形成抗地高辛配基碱性磷酸脂酶偶合物，利用该偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)测定.另外，还可用吖啶酯标记探针进行杂交，用硼酸钠将未杂交的探针分解，然后加入H2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最后测量吖啶的光通量.虽然这些方法安全、快速、但其敏感性还需进一步提高，操作还需进一步简化.四、PCR检测结核杆菌的敏感性和特异性(一)PCR的特异性PCR特异性的关键首先取决于所选靶序列的特异性.现在常用的靶序列有:①分枝杆菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型结核杆菌特异的靶序列，如mpt40序列.引物设计对PCR的特异性也至关重要.引物序列在靶DNA上的专一性、以及引物的特异性和保守性，以及引物本身的许多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特异性和保守性及引物长度等都影响PCR的特异性，另外在设计引物时也要防止出现引物间的过多配对，以免形成过多的引物聚合体，造成非特异性扩增.PCR扩增TB的特异性除上述先决条件外，也与PCR反应本身有极重要的关系.其中退火温度是一个重要因素，退火温度过低时，引物易发生非特异性结合，造成非特异性扩增.由于结核杆DNA中G+C含量高，因此可以适当提高退火温度，以获得更高的特异性.另外，PCR缓冲液的组成，尤其是Mg2+浓度对PCR的特异性也有较大影响，Mg2+浓度过高，会提高PCR产物的产量，但同时也会增加非特异性扩增.(二)PCR的敏感性PCR的敏感性很高，一般可以检测出1～100fg纯化的结核杆菌DNA，相当于1～20个结核杆菌，这种敏感性明显高于涂片法和培养法.PCR还可以检出培养法易发生失败的病例，从而大大提高菌阴结核病的诊断.另外PCR检测TBDNA不受抗痨治疗的影响，可以准确观察抗痨治疗的效果，防止血清学方法所带来的假阴性结果.PCR敏感性受下列因素影响:①扩增靶序列的拷贝数.一般认为，结核杆菌染色体中含靶序列拷贝数越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在结核杆菌染色体中只有一个，而IS6110序列的拷贝数却有10～12个，结果PCR敏感性后者比前者高100倍;②PCR的循环次数.在一定程度上，PCR循环次数越多，其敏感性就越高，但要合适.因为，循环次数过多会增加非特异性问题，造成结果判断上的失误，产生假阳性结果;③结核杆菌DNA的提取技术.处理标本时首先要富集(如离心)标本中的TB，使单位体积内TB含量变高，从而增加了起始模板数，有利于提高PCR的灵敏性.同时提取过程要尽可能减少抑制成份，并提高DNA的提取率.④PCR产物的检测方法.虽然DNA探针杂交要比直接电泳法敏感性高得多，但步骤繁琐，这也是影响PCR临床应用的原因之一.但一般情况下，直接电泳法的敏感性完全能够达到检测的需要.五.PCR在结核病临床诊断中的应用PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围，PCR检测TB的优点主要表现如下:1.能早期诊断TB菌血症:在TB感染的早期，特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时，PCR就能给于扩增并确诊.此外，由于外周血中TB的含量甚微，又没有新的病灶形成，因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的，而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义，因为早期菌血症是较易控制的，并可以防止继发性TB病灶的形成.2.时间短;PCR检测TB仅需2-4h对于某些培养法难以实施的病例，PCR法则行之有效，同时提高了敏感性和特异性，可以检测到1个TB菌.3.有利于鉴别诊断:对于肺结核来说，其中的结核球和成人型原发性结核等，经常易于同肺癌的诊断相混淆.病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的.在这种情况下，PCR检测就显得特别有效.它不但可以扩增能着色的活菌，还可以扩增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，从而确定这样的病灶是恶性还是良性.在许多情况下，TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点，但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值.PCR检测这类标本，可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水.另外，对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断，PCR都可以予以完成.4.抗痨治疗的评价:对于抗痨治疗效果的评价，以前的方法显得软弱无力.而PCR法则可以通过定期检测，采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度.在体内一般情况下，细菌死后，其蛋白系统很快崩溃，而DNA则能相对较长时间地保存下来.这些DNA在某种情况下又会复活.所以，细胞的死亡最可靠的评价指标是其基因DNA的完全降解.特别是在许多问题未搞清楚以前，更应该以DNA的降解来判定病原体的死与活.从理论上讲，PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标.5.修正以往所谓“正确”的观念:致病菌与机体的防御系统是一对激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打击人体的防御系统，以便其生存和繁殖.在健康人群和周围环境中都携带或存在有大量的TB，但何时何地才会造成机体致病呢?以往认为TB很少存在于外周血，这主要是因为外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺组织中.但很难让人相信的是，肺部血管极其丰富，淋巴组织和血管网共同构成人体的细胞外液贮存和交换的场所.所以，二者之间的交换是经常的.这种交换就包括能透过毛细血管壁的致病菌.当然，对于TB来讲，大多数细菌将被机体的免疫器官禁固起来.但仍有不少“漏网之鱼”，只是以前所用的方法敏感性及特异性均不够.但在某些情况下，如情绪低落、过度劳累、感冒等情况下，机体防御系统功能减弱，就会造成致病菌的攻击发生疾病.所以PCR技术对于评估临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义.六、PCR在检测TB中的注意事项PCR如操作不严格会出现假阳性和假阴性结果.发生假阳性最常见的原因是:样品间的污染和扩增产物的污染.样品间的交叉污染最易发生在样品的处理过程之中.如大家共用一个加样器、剪刀、位置等，因此在处理活检标本时，用剪刀剪碎组织块，每个标本用后，剪刀应在火上烧数分钟，以彻底清除污染在剪刀上的DNA.对于液态标本的处理，尽可能在同一管子内处理.用具应为一次性的.要解决好扩增物的污染，最佳的方式是减少操作的时间，简化操作手续并使用一次性离心管及接头.因为扩增产物的量一般很高，易于污染实验室任何地方.所以减少打开反应管的次数会降低假阳性的发生率.

结核杆菌培养特性 1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。 2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。 3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。详细的检测方法生物帮上面有的，蛋白质互作

你好！（一）漂浮法：1. 取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。2. 待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。3. 取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。(二)沉淀法：1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入酚红指示剂毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。2. 矫正PH为，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。3. 取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。这样回答就可以了，我要是导师就给你满分了！

结核杆菌抗原检测论文怎么写

例文1：肺结核不可怕——采访肺结核患者的报告开场白：敬爱的读者朋友，大家好！今天，我们带着关怀与疑惑的心情，来到县结核病防治所，采访一位来自张屯村的肺结核患者刘富贵先生。让我们一起来了解肺结核的特点以及患者的心声。本报记者：刘先生，我们都知道肺结核是由结核杆菌引起的肺部感染性疾病。请问您是什么时候怎样发现自己患上此病的呢？刘先生：俺是两个月前到县医院检查才知道的。挺长时间了，俺就觉的自己胸口有点闷的慌，干完活回来，经常咳嗽、吐痰，都三个多礼拜了。后来俺老伴非让俺到医院看看，俺就在村里卫生所王大夫那里做了个检查，也没检查出啥。他建议俺到县结核病防治所查查，说我的症状有点象肺结核，我想不会的，就没有去。可是再后来，慢慢地俺就咳嗽得越来越重，老觉得浑身发热、没劲儿、出汗，一下瘦了很多。这回俺就怕了，赶紧跑到县里做检查，还真是得了肺结核。本报记者：那医生又为你讲解和叮嘱了些什么呢？刘先生：医生说俺这病在痰中查出有结核杆菌的话还有传染性，要注意咳嗽、打喷嚏的时候要捂住口鼻，以免传染他人。还要注意房间的通风换气。但是只要正规治疗，很快就没有传染性了，经过正规治疗大部分病人都可以治好。本报记者：那么您相信您的病能治好吗？刘先生：当然了，人家医生都说了，现在科学发达，有特效药物治疗。治6～8个月就好了！还有，俺治病不花钱！县里有肺结核治疗的专门机构，免费给俺治呢！本报记者：待遇真好！最后，您还有什么话想对读者说呢？刘先生：俺就想说，要是怀疑自己患上了肺结核，得赶紧上结核病防治所去检查。肺结核不可怕，没发现才可怕！现在科学发达，啥病都能治好！别忘了，肺结核不可怕！老编感言：刘先生这席话，确实是真理，肺结核不可怕！昨天，死于结核病的人数颇多；但今天，肺结核不再是不治之症了！肺结核不可怕！但关键是要早期发现、正规治疗。--------------------------------------------------------------------------------例文2：肺的一封信可爱的人类:你们还好吗?我们可是糟糕透了。我就是肺,一个优秀的肺, 一个没感染肺结核的肺代表。唉, 我们的遭难来自于我们的克星——肺结核。它,害死了多少兄弟、多少姐妹呀,让我们肺不聊生。故此，跟各位人类朋友介绍此病,让我们的兄弟姐妹更好的为你们服务。我们可是一个相当重要的器官,它关乎人的正常呼吸,一旦得病,让我们肺痛,你们头痛,所以,我们一定要防止它的扩散。克星的主要传染途径是飞沫传播,当患有传染性肺结核的病人咳嗽打喷嚏时,排出含有结核杆菌的细小飞沫在空中,正常人吸入之后,结核杆菌便会在肺的深部繁殖,使我们倍受煎熬。常和患有传染性肺结核病人密切接触,最容易受到感染,因此,患有传染性肺结核的病人在打喷嚏或咳嗽时,应用手帕掩盖口鼻,病人居住的地方应该空气流通,阳光充足，尽量减小空气中结核菌的密度,就能够减少传染的机会。怎么样,很恐怖吧!这病让我提肺掉肺的,有时我的兄弟姐妹得病了,但人类没有察觉,这可真是苦了肺们了,真的不是你们不聪明,而是敌人太狡猾,因为感染后并不一定会生病,即使生病也不会立即有症状,大部分受结核病菌感染的人由于身体有足够的抵抗力,会自然痊愈而一生都不发病,但少部分受到感染的人,在身体健康情况欠佳,抵抗力较差时,藏在体内的结核菌会活动繁殖起来而发病。所以,你们一定要睁大你们那双慧眼让它们无处可藏。不过如果不小心让它们钻了空子,那也不用担心,去治疗嘛!听说你们的治疗技术超好,可以治好肺结核病。再次提醒朋友们,在治疗肺结核时，正确的方法是病人按规定服药，不能随便自己停药。相信肺---没错的!真的,千万千万别因为害怕而延误病情,不但使自己身处险境,而且别人也面临被传染的危险。如果病人好好的服药,两到三周以后慢慢不再具有传染性,就可以正常上班、学习,所以记住，如果所有的肺结核病人都去尽早治疗,就没有传染的来源了。人类小朋友、老人也不必怕,我在此教你几招：新生儿可以接种卡介苗来预防结核病,老年人主要靠加强锻炼,规律的生活,维持一定的抵抗力,使结核病没有可乘之机。其实,说到底,肺的保护完全在于人类自身,一定要注意卫生,咳嗽打喷嚏不要面对他人,每天保持空气流通，屋内阳光充足，难吗?不难吧!人类朋友们!千万要把握自己,健康是掌控在你们自己手里的。--------------------------------------------------------------------------------例文3：孙悟空治疗肺结核话说孙悟空陪唐僧取完佛经,便回到了花果山,继续做齐天大圣,可渐渐地,他发现自己整天呆在洞里实在难受,便决定出去闯闯。孙悟空一个筋斗翻到地球上，用火眼金睛一看，如今热闹的街道怎么变得冷冷清清？他立刻叫来土地爷，土地爷告诉他这里很多人感染了肺结核。孙悟空急忙问：“什么是肺结核呀？”土地爷说：“肺结核又称‘白色瘟疫’。多少年来给人们造成的影响不容忽视。”“那应该怎么治疗啊？”土地爷为难地回答道：“这个嘛……”孙悟空见状，知道土地爷也不知道。便拔下一根毫毛，变出一台电脑，查阅起肺结核的详细信息来：肺结核也叫肺痨，主要是通过呼吸道传染的，咳嗽、咳痰三周以上或者痰中带血就极有可能患了肺结核。这时孙悟空又拔下几根毫毛,变出许多个医生。这些医生为新发病的病人发了6个月的抗结核病药品，并装上定时器，要求他必须按时服用；对肺结核晚期的病人换上了新的人造肺；为新生的婴儿注射了卡介苗。他们还向世界各地宣传预防肺结核的重要性，听说他还要给学生讲课，让青少年增加卫生意识，注意开窗通风，加强身体锻炼，防止肺结核继续蔓延……就这样，悟空忙碌了一年。当新年钟声敲响的时候，人烟寂廖的地球村又恢复了往日的热闹。

作文？还是文章？有些这个作文的吗？不管怎样，要先了解肺结核病理去图书馆看医学类图书，要写作文的话，加上剧情就好了。

您好，预防肺结核建议您要勤洗手、多通风、多到户外参加活动，经常锻炼身体提高自身的免疫力，生活方面要规律，尽量避免一个房间多人居住，这样可以有效的预防肺结核。

完成心愿后，褚生转世投胎，成为吕老先生之子，以身报师，以魂报友。

大肠杆菌的检测论文

大肠埃希菌201株耐药性分析胆盐抑制冷冻保存大肠杆菌生长的研究分子生物学中常用的大肠杆菌菌株大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

我给你一些思路．

结核杆论文菌参考文献

医学论文参考文献著录原则与格式

原则上，所有必要的参考文献，作者都应该引用，并进行标注。参考文献是指为撰写或编辑论著而引用的有关图书资料。引用参考文献时应按其在文内首次出现的顺序，依次以阿拉伯数字在文前文后标注。

引用的参考文献应该经过挑选

随着医学科学事业的不断发展和进步，医学文献的数量和种类不断增加。作者在选用参考文献的时候需要经过筛选，需要用自己的知识和鉴别能力、，从众多的相关文献中挑选出科学的、有说服力的、有代表性的文献。如国不严格筛选，可能会得出错误的结果，不仅误了自己，也可能会误导读者。

按照循证医学()的思想，汇总分析(metaInalysis)的证据等级是很高的。即便如此，如果没有严格的综述(review)设计，汇总的是众多设计不严密、结果不可靠的文献，结果很可能事与愿违。因此，作者参考和引用文献时，需选择，不可随意引用。

引用的参考文献应该仔细核对

对拟选用的参考文献要什细核对，以免出差错。不仅在文字和著录格式上要核对，在内容上;也要与原文核对。作者对选用的参考文献，应逐一阅读.以正确理解作者的本意。

笔者曾经处理过一篇综述，文后大约有20余条英文参考文献，经上网核查，其中18条有差错。差错的种类大致如下：①作者姓名引用错误：按照医学期刊一般的要求，应光标国外作者的姓，再标其名字的首字母、如BillClinton，应标为“Clinton B”。有些作者常把国外作者的名和姓颠倒了。②单词拼写错误这种差错多为作者粗心大意，或者因没有与原文核对，而是通过转引所致。③页码有误，或者只标起页未标止页。④增刊没有显示出来。5则书籍未标出版社的地址等。

以上例子说明，作者对引用的参考文献进行认真核对是十分必要的，是对读者负责，也是对自己负责。

引用的参考文献要忠实于原文

因为是引用别人的文献，作者无权更改原作者的本意，只需向读者介.介绍原作者使用的方法、得出的结果和结论等。作者可以对原作者使用的方法、得出的结果和结论等发表看法，但不能肆意更改，不管是故意的，还是无意的。

要想忠实于原文，最好的`办法就是用之前仔细阅读原文，正确理解作者的本意，尽量不要转引，以免以讹传讹，损害原作者、读者，还有自己。

应注意参考文献的著录格式

因参考文献的著录格人各刊不尽相同，投稿前作者应注意杂志稿约的有关规定，至少得先看看有关期刊发表的论文的参考文献是如何标注的，以了解有关期刊的参考文献的著录格式，以免出错。

很遗憾，在实际工作中笔者发现，有不少作者投来的稿件书写格式包括参考文献的著录格式与杂志所要求的不同。坦率地讲，编辑和审稿专家也是人，工作中多少也有感情因素。如果拿到手中的是一篇书写格式不合要求的文章，别的暂且不论，就书写格式不规范这一条，就足以给编辑留下不好的印象，甚至让编辑做出退稿的决定。就算最后没有被退稿，此类稿件较书写格式规范的稿件被录用的可能性大大降低。

其实作者犯的是一个很低级的错误，让编辑很自然地联想到，该作者不太尊重期刊，还有期刊的编辑以及审稿专家。因此，作者在投稿前一定要注意期刊参考文献的著录方式，以免产生不必要的负面影响。其实，并不复杂，只要，稍稍留意即可。

附：中华医学会系列杂志参考文献的著录格式

中华医学会系列杂志有固定的参考文献著录格式，但即便是同一种期刊，不同种类的参考文献的著录格式不相同。下面列出作者经常使用的发表在期刊和书籍中的文献的著录格式。

书籍

1.专著：需注明作者、书名、出版社及其地址、出版年份和起止页码等。

例1(中文)：戴自英，刘欲昆，汪复。主编实用抗菌药物学.第2版上海科学技术出版社，～78.

例 2英文)： Guyatt G， Rennle D。 Users’guides to the medical literature-Chicago： AMA PrCss，。400。

3.专著中析出文献：例1(中文)：蔡映云.湿化治疗与雾化治疗.见罗慰慈，主编北京：人民军医出版社，1997362～365.

例 2(英文)： LIVOTffiofO DM;Williams of actionand mechanisms of bacterlal ：LOflapV，：Will。flains&Wilkins，。578.

期刊

1.期刊不分卷：只需列出作者、题、刊名、发表年份、期序和起止页;即叮。如： Turanl， WredmarkFellander-TsalL. Arthroscoplc ankle athrodesls In rheumatoid . Orthop，1995，(320)：110。114.

2.期刊分卷，连续编页码;除了作者、文题、刊名、发表年份和起止页码外，还要标卷，但无须标期。如;邓伟吾。走出应用抗菌药物治疗误区。中华结核和呼吸杂志，2002，25：705～706

3.期刊分卷，每期单独编页码：需要同时标注卷和期。如汪国华，马进季适东，等.急性出血坏死性胰腺炎的手术治疗.中级医刊， 1995， 30( 8)：22～25.

4.期刊无卷和期：无法标注卷有期，只标年份、如 Browed DA， status of the cancerPatients and the effects of blood transfu-slon on ， 1993：325～333.

5.卷的增刊：需在卷后标注“增刊”(中文)或“SPPPI"(英文)字样。如： Clyde WA Jr. Clinical overview oftyplcalMycoplasma pneomonlae infections Clin Infect Dis，1993，17 Suppl l：532～536.

6.期的增刊：需在期后标注“增刊”(中文)或“SUpd”(英文)字样。如 Pnyne DK， Sullivan MD， Massie ’s psychological reactlons to Oncol， 1996，23(ISuPPIZ)：89-97

7.卷中分部：需在卷后标注分部。如： Ozben T， Nacitarhan S， Tuncer and unne slallc acid In non-Insu-lin dCpendent diabetes mellitus Ann ClinBiochem， 1995， 32(Pt3)： 303。306。

8.期中分册：需标注分册。如：Poole GH， Mills SM. One hundred con-secutive cases of flap lateraDons ofthelegin aging patients N Z Med J，1994，107(986Ptl)：377。 378.