基因克隆技术论文

克隆是英文clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后，再被植入动物子宫中使动物怀孕，便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。克隆技术研究现状一、克隆的早期研究克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。三、近3年来克隆研究的重要成果克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。 1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。 2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。四、克隆技术的应用前景克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998，Science），而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。五、克隆技术存在的问题尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟，在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。在实践中，克隆动物的成功率还很低，维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有％和％，即使是使用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。此外，生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战，美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月，英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告，表明英国政府将重新考虑这一决定，认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举，关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。

简介白细胞介素，简称白介素是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，白介素它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。[编辑本段]特征白介素2（IL-2）分子量为万的糖蛋白，对T细胞激活及生长有作用。IL-2主要由CD4＋和CD8＋T细胞产生，IL-2主要以自分泌或旁分泌方式发挥效应。不同种属间，IL-2沿种系谱向上有约束性，向下无约束性。IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，并参与抗肿瘤效应和移植排斥反应。[编辑本段]作用介绍 1． IL-2对T细胞的作用 IL-2是T细胞生长因子，能使T细胞在试管内长期存活，刺激T细胞进入细胞分裂周期。IL-2能增强T细胞的杀伤活性，在体外它与IL-4、IL-5和IL-6一起共同诱导细胞毒性T细胞（Tc）的产生，并使其活性大大增强，延长其生长期；在体内IL-2也能增强抗原诱导的TC活性，甚至可以辅助抗原和半抗原直接在裸鼠体内诱导产生TC¬。白介素由IL-2诱导产生的TC输入体内后可产生明显抗肿瘤作用，但TC在体内不易存活，如同时再输入少量IL-2，则可明显延长Tc在体内的存活时间，并增强其抗肿瘤效果。 IL-2并可诱导T细胞分泌IFN-γ, TNF, CSF等细胞因子。 2．IL-2对NK细胞的作用 IL-2可促进NK细胞的增殖，维持NK细胞长期生长。肿瘤病人经IL-2治疗后，血中NK细胞数量明显增加。IL-2在体内、外都能增强NK细胞活性。在体外，IL-2于短时间内就可使NK细胞活性增强。肿瘤病人经IL-2治疗后NK细胞活性变明显增强，且有累积效应，即随着IL-2剂量的增加和疗程的延长，NK细胞活性亦因之不断增强，IL-2并能矫正NK细胞活性低下状态，使之恢复正常或超过正常。白血病病人外周血单核细胞（PBMC，其中10％是NK细胞），经IL-2培养后具明显的细胞毒作用，以此输回给病人治疗白血病。IL-2还能促进NK细胞分泌IFN-γ，增加其表达IL-2R+亚基等。 3．IL-2对LAK、TIL细胞的作用 IL-2可促进LAK, TIL细胞的体外存活、扩增及活化LAM（即淋巴因子激活的杀伤细胞lymphokine activated killer cells）。LAK是淋巴细胞与IL-2接触后产生的一种具有高效抗肿瘤效应的杀伤细胞，只有在IL-2的存在下LAK才能产生，亦只有在IL-2存在下，LAK才能发挥其效果。实验证明，淋巴细胞经IL-2培育后所得LAK细胞的活力，比不加IL-2培育的强100~1000倍，而且LAK只识别肿瘤抗原，对宿主正常细胞没有影响。LAK与IL-2合用，对原发性及转移性肿瘤，均有明显抗肿瘤作用。 LAK与IL-2合用治疗肿瘤虽取得了临床效果，但在制备LAK时须抽取病大量周围血单个核细胞，须多次回输并伴用大剂量IL-2，价格昂贵且毒副作用大，于是人们极力寻找一种抗肿瘤效果好、毒副作用小的方法于1986年从实体瘤组织中分离到肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL )，在体外经IL-2激活可大量扩增，并对肿瘤细胞具高度杀伤作用，其体外杀伤肿瘤的效果比LAK强50~100倍，并仅须伴用少量IL-2就可发挥明显抗肿瘤效果，毒副作用小。 4．IL-2对B细胞的作用 IL-2可促进B细胞表达IL-2R，促使B胞增殖和产生免疫球蛋白，并刺激巨噬细胞，提高其吞噬能力。近年发现，重组IL-2可刺激某些中枢神经细胞的生长和成熟，并作用于吗啡肽受体，产生镇痛作用。有关白细胞介素一2 (IL-2 )的调节免疫作用。 5．IL-2对肿瘤细胞的作用 IL-2的抗肿瘤作用除与LAK, TIL有关外，还与其诱导NO的产生有关。实验发现对LAK无效的Meth A小鼠皮肤癌，用IL-2治疗可见存活期延长，且小鼠尿中NO2¬¬¬-含量较对照组高8倍；如同时应用NO诱导抑制剂L-NMMA，使尿中NO含量下降60%，同时使IL-2组的存活期大大缩短，提示IL-2诱导NO合成，是其抗肿瘤作用机制之一。

我给你找了几篇，累死我了。呵呵。标题都可是《有感于克隆》 1 近年来，“克隆”二字在媒体刊物中频繁出现，吸引着人们好奇的眼球。“克隆人”技术的可行性和合法性在科学和道德等方面引起了人类广泛的争议。 “克隆”一词是一个泊来品，是英文clone的音译。简单地讲“克隆”就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与一般的无性繁殖是有区别的，科学家把人工遗传操作动物的繁殖过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。克隆技术可以精细到以单个基因复制为单位，科学家将某种特定基因单离出来，将它与某有机体如某种酵母相结合，有机体将新基因融入自己的DNA结构后再行繁殖，产生出理想基因的复制品。 “拷贝”也是一个泊来词，它来自于电子文档的“copy”。在某种意义上来讲，“克隆”和“拷贝”具有一定程度的相似性。有时候哀叹中华文化的“纯正性”遭到泊来品的侵袭，使得诸如这些clone、copy、DNA之类充斥于方块汉字之间。有时却也为人类文化遗产的大融合而感到欣慰。前些天临写虞世南《孔子庙堂碑》，写到“圣期大唐，运膺九五，……于是在三睠命，吹万归仁，克隆帝道，丕承鸿业”，突觉眼睛一亮，这“帝道”还有可以“克隆”的？难道古人早已知道千年后的今天要产生一种“克隆”技术，或者说现代科学的术语与古人思想暗合？如果“帝道”可以“克隆”的话，我们只要照样“拷贝”三皇五帝、鸟生渔汤（尧舜禹汤），甚至“贞观”“开元”，岂不是好！《孔子庙堂碑》为虞世南撰文并书写，碑文记载唐高祖五年，封孔子二十三世后裔孔德伦为褒圣侯，及修缮孔庙之事。虞书对于后世书风影响极大，黄山谷曾有“虞书庙堂贞观刻，千两黄金哪购得”之说。以前临写碑帖，重点放在其书法结体方面，对碑帖的内容只求有一定程度的了解，而不做太多的深究。怀着某种奇妙的心情，这一次认真仔细地研读了《庙堂碑》的碑文内容，对其中漫患缺失之字也进行了相当的考究，有些地方还专门请教了有关的专家学者。世界上怕就怕认真二字。深究之下，原来此“克隆”非彼“克隆”。在“克隆帝道，丕承鸿业”中，“克”作“能够”解，如“克尽职守”、“克承”等均含此意。而“隆”可解释为“尊崇”或“使兴盛”，前者如“学之经，莫速乎好其人，隆礼次之”（《荀子》），后者如“隆国保家”等。于是乎“克隆帝道”可以解释为“能够尊崇帝王之道”“能够弘扬帝王之道”。 “克隆帝道”与“clone帝道”虽然其意不同，后者却也能自圆其说。如果能够使帝王之道“批量繁殖”，使人人皆成孔孟，岂不天下大同，从而实现圣人之治？一时有感，是故乱侃。 2 随着“克隆”时代的来临，想必我们对“克隆”本身并不陌生，但随着“克隆”一词的广泛延伸到生活中，生活中无处不充满“克隆”的气息，而文学作品也成为“克隆”的理想温床。而我却甘愿“克隆”，因为我们都知道，任何一个文学大师，他都是从“克隆”别人的东西，来寻找自己的理想之路，从别人的写作方式吸收营养变成自己的东西，当他到一个阶段后“克隆”这时就变成了自己的东西，那时他就不需要再“克隆”，有了自己的精神世界，别人的精神世界就无法容纳自己的思想了。而有一种现象非常有趣，当我“克隆”别人的作品时，我发现也有人“克隆”我的东西，有句话说得好，好文传天下，真正传的是一种情绪，而正是这种情绪使人们明白生活不是梦境，但求个心灵自由。这时我会非常的高兴，高兴大家一起玩同一个文字游戏。如今是一个善于炒作的年代，往往一篇文章会出现不同的版本，后来才发现大家不过玩得是一个命题作文，遍地开花而已。这种跟风的思想是每个人都常有的，所以最时髦就是吃别人剩饭，比如写一篇以流行歌曲命名的文章，这样往往会起到非常好的共鸣效果。其实这也是一种“克隆”，他是“克隆”本身的延伸、扩大和其他。而我们往往沉迷其中，因为爱所以爱，哪怕是虚伪也乐此不疲。当一个人名气大过一个人的时候，别人只当你是换了一个马甲，那时那些克隆别人东西的人才发现，他只不过成了原作者的阶石，成全了别人的更大名气和利益，比如网络上的一些查询功能就可以方便一些人进行更大力度的宣传，一些并不熟悉的网站，通过你的克隆会使原作者发现新大陆，使他更为兴奋，能更好地向全世界宣传，让世界都知道他，让他与世界沟通，这时“克隆”就是一种享受，何乐而不为。现代社会是一个知识抢夺的时代，你想得到的，别人同样想得到。这时克隆好像长得像的人，只不过做着异曲同工的事罢了。如今的一些名家大师们当然很少上网，但是他们特别注重知识产权的保护和个人利益，作为没有什么名气的我，我甘愿“克隆”，我知道我甘愿的目的不在不保护自己的知识产权，也不在于随便侵犯别人的知识产权，目的是改变自己的思想世界，使自己能够有自己的独特掌握思想世界的能力，这时“克隆”的双赢效果就达到了。当然，那些不善于“克隆”的人往往会引发官司那你们就得不偿失了。我总结了我的“克隆”经验：首先，要有自己独特观点，“克隆”别人的东西首先要精华原作，再加上自己思想内容，特别是题目要取得引人入胜，心理学上叫混淆视听，让人们感觉你才是原作者；其次，要在文头和结尾段落尽量不要和原文一样，文字游戏玩一玩也不是很难的，我就不多说了，我想大家都明白；最后，一篇“克隆”文章成不成功，最重要的就是丰富其框架，你可以打破原有所有文章的框架，重新组合，使文章焕然一新，成为你自己的东西。甘愿“克隆”的时代，是人们与日益增长文化需要的一种代替品，他的出现将会很长一段时间存在，但从“克隆”变成真正的自己，那就看自己能不能找到自己的路，有时一个人一生也找不到，有时一个人会在很短时间找到，许多文学大师就是找得快速的人。所有的悲欢离合都是梦，“克隆”痛并快乐着，克不克隆就让时间证明一切，时间取决了一个真实的你，一个真正的世界，一篇真实的文章。而人们却永远忘记了作者，所以人们看懂的只是情绪，作者不过是历史长河中的一颗沙，好渺小。谁也不知道那些古人的作品是不是就是自己原创，而古代一个个写作家的写作，为了只是心情愉悦，并没有想美名传千载，我们这些后人只是受益者，因为那些思想的撞击，使我们更了解古代人的生活等各方面的事情，具有研究价值，除此之外，我想一个对文学不感兴趣的人，文学就是很肉麻而且无用的东西，但我们都知道，一个真正读懂的人，他所体会到得东西只是一种情绪，也只能是一种情绪。因为人是多愁善感的，才丰富了如今的文化市场，有看者才有写者，所以才有“克隆”。更映证了一句话：“天下文章一大抄，那管谁是真英雄。”参考资料：我在红袖的文集，欢迎光临：

我从课外书上获知，现在已经有了克隆技术。人只要在植物或动物、人类的身上取下一个细胞，就能克隆出一个和他（它）一模一样的人或物来。我想，假如我成了克隆专家，我一定要克隆出许许多多对人类有益的东西。假如我会克隆，我一定要将大地上的树木克隆得越来越多。我要让每个山村、每座城市，还有那无边无际的沙漠都被绿色覆盖。而且我克隆出的这种树是速生树，这种树能在半年内长成大树，使大地绿树成荫，四处开满鲜花，四季不败，使大地永远一片生机勃勃的景象。这时，我相信我们的地球一定会变得更加美丽、可爱。假如我会克隆，我就要克隆出许许多多珍稀动物。如大熊猫、东北虎、朱鹮、扬子鳄等。除了珍稀动物，我还要克隆出许多珍稀植物，比如银杏、水杉、人参等。不仅让它们生长在祖国的各个角落，而且遍布地球的其他各个地方，让“珍稀动植物”这个词语自动消失。到那时，地球村该是多么美丽啊！假如我会克隆，我要把那些知识渊博、心地善良却已不在人世的人都克隆出来，让他们和以前一模一样。但是，要想让这一切变成现实，我必须踏踏实实地学好本领，为这一理想的实现而努力奋斗。

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xxxx大学xxx学院xxx专业研究生xx所完成的题目为“”的学位论文，选题适当，具有较深的理论意义和广泛的实用价值。作者系统地归纳和综合地评述了有关文献，掌握了该领域内的研究现状和发展方向。本文作者通过大量的文献阅读和亲身的实践经验研究了一种基于xxxx的xxxxx法，完成了对xxxxxx，并设计出了xxxxxxx系统。

论文取得了下列研究成果：

1、详细介绍了基于xxxx的xxxxxxx法，并与传统的xxxxxx法进行了比较，总结出每种xxxxxxx方法的优缺点，指出采用xxxxxxxx法的优势。

2、研究并设计了基于法的xxxxxxx电路。由于采用该种方法不需要xxxxxxxx电路，因此，解决了传统的xxxxxxx等问题。

3、研究并设计了基于的xxxxxx硬件电路。其中，包括对控制电源、单片机外围电路、驱动电路、逆变电路以及保护电路的设计等，并在硬件电路设计中考虑了软硬件抗干扰措施。

4、介绍了在xxxxxxxx模式下的常用的xxxxxxx方法，详细分析了xxxxxxxx控制中最常用的xxxxx技术，并编写出了程序，使xxxx能够顺利xxxxxxxx。

5、完成了控制系统的调试工作，其中包括硬件电路的调试和整个系统的软硬件联调，最后给出了系统调试结果。

论文工作表明作者已经掌握本学科扎实的理论基础和深入系统的专业知识，独立从事科研工作能力强。论文结构合理，论述清楚，逻辑性强，已达到学术硕士学位论文的要求。

答辩过程中表达清楚，回答问题正确。答辩委员会一致同意通过答辩，并建议授予其学术硕士学位。

系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎都是由基因和环境因素相互作用的、临床表现复杂的自身免疫性疾病。被用于研究PTPN22基因多态性与云南汉族系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的相关性。

论文采用2个群体（SLE，RA），应用PCR—RFLP和直接测序的方法，对PTPN22基因7个SNPs（rs1217414，rs1217418，rs3765598，rs1746853，rs2470601，rs1970559，rs3811021）多态进行检测，并对检测结果采用、、HaploView软件进行数据统计分析。并对各个位点的多态与系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎相关性进行讨论。得到如下结果：

1、PTPN22基因C1858T位点在云南汉族人群中无多态性。内含子rs1217414，rs1217418，rs1746853多态性可能与云南汉族SLE，RA相关。内含子rs1970559与云南汉族SLE，RA无关。rs3765598和rs3811021位点突变可能与云南汉族系统性红斑狼疮相关，rs3811021位点突变可能与云南汉族类风湿性关节炎相关。

2、rs1217414，rs1746853，rs3811021位点突变与系统性红斑狼疮各临床指标无关。rs1217418突变可能与WBC有关，rs1970559可能与BUT，WBC有关，rs3765598可能与抗ANA1和抗ANA2抗体有关。

3、单倍型（CATTCT）为主要单倍型。单倍型（CAGTCC），单倍型（CATTCC）和单倍型（TATTCT）显著降低系统性红斑狼疮风险性（PPAGTTC）

论文选题新颖，有一定创新性，实验设计和实验结果科学。论文内容丰富，写作规范，逻辑清晰，结构合理。答辩回答问题正确，思路清晰，已达到硕士研究生水平，一致通过答辩，建议授予理学硕士学位。

xxx同学采用实验研究法，通过干预社区脑卒中患者的功能锻炼，探讨以保证脑卒中患者肢体功能得到更大程度的恢复，身体状况得到更大的改善为最终目标，寻找一种高效的功能锻炼指导模式，确保社区居家脑卒中患者能够获得系统、规范、连续的功能锻炼指导，为其进一步康复提供保证。使出院脑卒中患者能在住院治疗后的恢复期中得到持续的卫生保健服务，最大程度的重建患者肢体功能，预防再复发。同时，该探究将有利于节约社区卫生服务成本，提高社区医护人员对于脑卒中管理的效率及效果，最终产生良好的经济社会效益。该论文选题鲜明，具有实用性，研究设计较合理，所得数据真实可信，统计方法使用得当，结果分析较深入，论文撰写格式符合要求，该论文已达到硕士学位论文的要求。该生在论文答辩中回答问题实事求是，思路清晰。经答辩委员会无记名投票，一致通过论文答辩，并建议授予医学硕士学位。

答辩委员会主席：

xxxx年xx月xx日

XX 同学的硕士学位论文《XXXXXXXXX》，选题紧跟我国禁烟控烟的热点话题，科研设计简单合理，具有一定的理论价值和现实意义。依据世界卫生组织发布的《烟草控制框架公约》和近 5 年来发布的《中国控制吸烟报告》，确定预防的重点对象是年轻的大学生群体，在文献研究和时事动态分析的基础上，对高校大学生吸烟与被动吸烟现况进行了横断面调查研究，以及详细分析了其各自的影响因素。论文内容真实，层次分明，逻辑性强，图表清晰度有待加强，论据比较充分，数据准确，资料详实，统计学处理正确，结论可靠。答辩时的论述符合一般逻辑，能够正确回答问题，论文表明作者掌握了社会医学与卫生事业管理专业的基本理论和医学社会科学研究方法，知识面比较宽广，拥有较强的独立科研能力。答辩委员会认为本篇论文达到了硕士学位研究生论文水平，答辩委员会委员全体无记名投票通过论文答辩，建议授予医学硕士学位。

本论文主要研究裂褶菌F17锰过氧化物酶的酶学性质，并在单因子分析法的基础上，通过响应面法优化了影响该酶活力的各个因素。同时将研究的结果应用于染料脱色中，发挥其在环境保护中的作用。作者还初步进行了基因克隆实验，并且优化了反应体系，获得了一些序列。这些研究结果对于进一步研究、开发应用锰过氧化物酶具有一定的参考意义。论文立项具有一定的理论意义和实际应用价值。

该论文目标明确，研究路线合理，实验数据翔实，实验结果可信，观点正确。论文书写规范，层次清晰，图表规范。作者答辩表达清楚，回答问题思路清晰，论文已达硕士论文的学术水平。

经答辩委员会讨论评议和无记名方式投票表决，一致通过其毕业论文答辩，建议授予理学硕士学位。

本论文主要探讨了产广谱乳酸菌素菌株的.筛选、鉴定、发酵的全过程。筛选到了一株既可抑制革兰氏阳性菌又可抑制革兰氏阴性菌的乳酸菌，经鉴定是一株植物乳杆菌;又通过摇瓶发酵数据优化了菌株发酵条件;并初步探索了菌株固定化的条件。该论文立意新颖，研究目标明确，数据方案设计较合理，方法可靠。论文研究为进一步探索乳酸菌素的生产条件提供了依据与实验研究基础，具有一定的应用价值。

该论文书写规范，逻辑性强。答辩表达清楚，回答问题思路清晰，论文已达硕士论文的学术水平。

硕士学位论文答辩委员会决议：分布式视频编码是一种新兴的编码框架，它可以将计算复杂度从编码端转移到解码端，同时具有较好的压缩效率和抗误码能力，非常适合于一些新兴的应用场合。论文对分布式视频编码中的 WZ 帧编码技术进行了研究，选题科学，具有较高的理论研究意义和实际应用价值。论文首先利用统计学的原理分析证明边信息与待解码 WZ 帧之间的较强相似性，提出以边信息来填充 WZ 帧高频子块的思路，并将其运用到嵌入式分级编码中，构造出改进的基于 DCT 和小波变换的 WZ 帧编码架构。实验表明，改进方法与 (帧内编码)、(帧内编码)的性能相当。论文概念清楚，分析严谨，理论推导正确，做了较多的仿真实验，并对实验结论作了理论上的阐述和讨论。论文有创新，表明作者在本专业具有扎实的理论基础和系统的专门知识，有较强的独立从事科研的能力。答辩时，条理清楚，回答问题正确。经答辩委员会讨论，一致同意通过硕士论文答辩，建议授予工学硕士学位。

本文对分级进风燃烧室内的高温气固两相流动与燃烧过程进行了实验研究，对于了解分级燃烧过程的两相流动、燃烧与污染物生成机理，发展分级燃烧技术，具有重要的学术意义和实用价值。

本文取得了以下主要成果：

1）建立了分级进风燃烧室高温气固两相流动热态实验装置系统。

2）应用三维激光粒子动态分析仪对分级进风燃烧室内有气相燃烧的高温气固流动进行了测量，得到了气固两相平均轴向与切向速度和湍流脉动特性以及两相轴向与切向速度的概率密度函数，揭示了燃烧室内高温气固两相流动的特点。

3）对分级进风燃烧室内湍流燃烧的温度场和组分浓度场进行了测量，阐明了二次风率对气体温度场、组分浓度场和NO浓度场的影响规律。

论文表明作者掌握了本学科坚实的基础理论和系统的专门知识，具有独立从事科学研究工作的能力。论文写作规范，图表完备。答辩中叙述清晰，回答问题正确。答辩委员会经表决，5票一致同意通过论文答辩，并建议授予郑晓川工学硕士学位。

速生材改性研究是木材科学与应用研究领域十分重要的课题。论文选题紧密结合学科发展和实际应用需要，具有较强的理论意义和较好的应用背景。立题正确。

作者对国内外在木材改性领域的研究情况和发展趋势做了较充分的调研和分析，在此基础上，有针对性地开展了三倍体毛白杨木材化学改性研究。论文采用4种不同的方法对木材进行化学改性处理，通过尺寸稳定性、阻燃性、抗吸水性、硬度等的检测，考察了各种改性木材的物理力学性能，得出以下主要研究结论：

1）用含有纳米SiO2的UF、PF树脂复合处理剂处理木材时，二氧化硅对提高木

材的尺寸稳定性和硬度具有明显的作用，且纳米二氧化硅能够降低处理材的游离甲醛释放量；2）马来酸酐/苯乙烯和马来酸酐/环氧氯丙烷复合处理液均能够在一定程度上提高木材的尺寸稳定性、抗吸水性、抗吸湿性和硬度。研究成果具有一定的理论意义和实际应用价值。

论文实验设计合理，数据完整，撰写认真，文字流畅，图表清晰，工作量饱满。论文答辩中，讲解重点突出，回答问题基本正确，表明该同学具有较好的本学科理论基础及相关的专业知识，具备了较好的综合分析能力和从事科研工作的能力，论文达到了硕士学位水平要求。

全体答辩评委一致同意通过论文答辩，建议授予工学硕士学位。

随着计算机主频、内存的快速发展，显示清晰度和显示尺寸的限制已经成为计算机系统的瓶颈。如何利用高性能价格比的机群实现超高分辨率的高清晰度大尺寸显示正在成为并行可视化方向一个重要的研究课题。李颖敏同学的硕士论文以设计基于机群的拼贴显示系统提供方便的编程接口和编程环境为目的，其选题具有前瞻性，论文的工作有很好的应用前景。（第一段：选题的意义）

论文在分析调研国际目前研究动态的基础上应用“分布式共享显示内存”的新概念提出了一种并行程序环境下的拼贴显示接口，并以两种形式实现了该接口，简化了系统应用的编程实现。提供了一些测试用的应用程序，为今后的研究工作提供了有参考价值的研究平台。展示了基于机群作分布式显示的良好前景。同时作者还利用该拼贴显示接口为一个地理图像信息系统实现了多屏显示应用，满足了该应用对高分辨率显示的需求。（第二段：论文工作取得的成果或新见解）论文工作表明作者基础理论和专业知识都比较好，掌握了计算机系统结构领域分析问题、解决问题的基本方法和技能。对拼贴显示领域有较深的了解，对机群系统，尤其是有较好的基础知识和技术，具备了一定的独立工作能力和实际动手能力（第三段：对科研能力及对论文的评价）

论文组织合理，叙述清晰，文字简洁流畅，理论与实践结合得较好。答辩中表达清楚，思维敏捷，能够正确回答问题。经答辩委员会无记名投票，一致通过该同学的硕士论文答辩，并一致建议授予李颖敏同学工学硕士学位。（第四段：答辩中的表现及结论性意见）

去下模版啊，很方便的啊

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克隆技术论文参考文献

利：克隆的发展，也是医学的发展，设想如果有一天，你的某个脏器衰竭了，或者再假如在一次车祸中，你的某个脏器破裂了，你就可以用克隆的器官弊：社会人伦混乱；或者说，你的脏器坏了，拿一个克隆人的脏器，那克隆人呢？看过《克隆岛》吧，那里有关利弊，电影里讲述的很好，嘿嘿

随着科技的发展,,思想的解放，作为20世纪人类生命科学三大发明之一克隆技术，越来越受到世人的关注。针对这一热点问题，分析技术本身的利弊，得出自己的观点：支持治疗性克隆，反对生殖性克隆，从而使克隆技术回到造福人类的这一初衷上。2005 年3 月8 日《, 联合国关于人类克隆宣言》在第59 届联合国大会以84 票赞成、34 票反对、37 票弃权的表决结果获得通过。宣言敦促各国政府禁止一切形式的人类克隆,包括用于干细胞研究的人类胚胎克隆。这说明各国在克隆人问题上的分歧仍然很大,许多问题还需要人们作深入的和公开的讨论。目前,国际上一般把对人类自身的克隆分为“生殖性克隆”和“治疗性克隆”。前者是指对整个人的复制,即从被克隆的人身上取得细胞之后,将其植入被去除了遗传基因物质的卵细胞空壳中,通过刺激使新卵细胞分化并形成胚胎,之后将胚胎植入母体的子宫里孕育。克隆婴儿具有与遗传物质源相同的生理特性。治疗性克隆通常指出于治疗目的而克隆人的胚胎,提取胚胎干细胞,并使干细胞定向发育,培育出健康的可以修复或替代坏死受损的细胞、组织和器官,通过这些被培育出来的组织细胞或器官的移植而治疗疾病。这种用于医疗目的而在实验室使用克隆技术制造胚胎的过程被称为“治疗性克隆”。目前世界各国政府对于克隆人基本都持反对态度,但是对出于医学治疗目的的克隆尚有分歧意见。1、反对生殖性克隆。1．1 目前，世界人口约为61亿，联合国有关机构预测，到本世纪中期，将会再增加30亿。面对资源的耗竭，环境的破坏，一再增长的人口只会使生态长期处在恶性循环中。生殖性克隆在解决世界人口问题时，不但不能发挥科学指导作用，反而火上加油，将恶劣的局面推至极限。1．2 另外，全球有大约15%的已婚夫妇受到不育问题的困扰，这些特殊人群是克隆的潜在需求者。既然每个人都享有生育权，那么他们寻求辅助生殖技术的做法看似符合道德准则。但事实上，克隆人存在着极大的技术风险和安全隐患。克隆对克隆婴儿本身是不安全的。已进行的动物克隆实验表明,克隆的成功率非常低。从细胞核移植开始到克隆羊出生,总的成功率是1/ 434 ,即用434个含体细胞核的卵移植至去核卵内,最后只有一个成功,即克隆羊“多莉”。人比羊要复杂得多,因此,克隆人要比克隆羊成功率会更低。在克隆成功率非常低、克隆后代容易得遗传缺陷的情况下,贸然进行人类的克隆,无疑是不人道的。1．3 克隆人扰乱家庭关系。反对克隆人的另外一个理由是克隆人将彻底搞乱家庭的人伦关系。人都是父母所生,并且在长期发展过程中形成了以血亲为基础的家庭关系。可在克隆人那里,自然的男女结合的生育模式被打破。因此以两性关系为基础的家庭关系将被打乱,按通常定义的父子和母子关系将出现问题。克隆还可能导致父女协作生育父亲、祖孙三代由同一“种子”克隆等颠倒人伦、辈份和世代的事情。2、支持治疗性克隆。近年来，绝大多数科学家都主张政府禁止进行克隆人的实验，而对是否禁止治疗性克隆的意见不统一，而且支持治疗性克隆的声音大于反对的声音。相对于生殖性克隆，治疗性克隆相对而言更加成熟，因为它提出了一条把体细胞克隆与人类干细胞体外培养、诱导分化结合起来的新型的临床治疗路线，为医学的发展提供的广阔的背景，这也是克隆技术迅速发展的原因之一。2．1 消除基因性疾病的可能性。治疗性克隆里的核移植技术与基因工程相互结合之后，可以利用外源基因的导入，特定基因的缺失和基因的突变为基因治疗提供全新的手段。同时，从根源上消除基因性疾病的产生基理、减少基因性疾病的发病率。2．2 治疗性克隆可治疗多种疾病。治疗性克隆的研究是和干细胞研究紧密联系在一起的。胚胎干细胞具有早期胚胎细胞形似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖，能分化成为200 多种细胞类型，从而进一步形成人体的多种组织或器官。因此，如果治疗性克隆的研究获得成功，血细胞、脑细胞、骨骼和内脏都将可以更换，这给白血病、帕金森病、心脏病和癌症等疾病患者带来生的希望而且，治疗性克隆的更大优势是它利用了具有患者自身基因的干细胞，这种治疗方法会最大程度减少副作用的产生。3. 思考与探索。关于克隆人的争论大大深化了我们对人的生命的价值的认识。在这个世界上,人的生命是第一重要的,没有任何一种价值可与人的生命的价值等值。生命是最高价值,其他一切都为它服务。因此,在伦理领域,我们的第一原则就是要尊重生命. ,即尊重人类每一个个体的自然生命存在、健康及其获得幸福的权利。我们相信,由于治疗性克隆的研究和临床应用的潜在医学价值是显而易见和值得寻求的,挽救千千万万患者宝贵生命是对人类生命价值的最高尊重,它与人类所追求的伦理标准也应该是一致的。只要科学家本着对社会负责的态度,克隆技术最终会造福于人类。

导读：无缝克隆技术是时下最流行的质粒构建技术，几乎每个分子生物学实验室都在使用。之前我给大家详细讲解了Gibson Assembly的实验设计和操作流程，那么这次给大家介绍另外一种无缝克隆方法——Golden Gate Assembly，希望能对大家的质粒构建实验有所帮助。说到分子克隆，几乎每个做过质粒构建的小伙伴都知道Gibson Assembly，这个方法实在是太流行了！记得我刚进实验室的时候，师兄师姐教我构建质粒所用的方法就是Gibson Assembly，那个时候整个实验室的人都用Gibson Assembly，我才知道高中生物课和本科生物课上所学的经典的酶切连接方法早就不流行了。后来我看了很多文献，发现除了Gibson Assembly之外，其实还有很多好用的质粒构建方法，与Gibson Assembly几乎同时出现的Golden Gate Assembly就是其中的一种，这两种方法都可用于无缝克隆。 Golden Gate Assembly是一种新型的酶切连接方法 [1, 2]，与传统的酶切连接方法不同。传统的酶切连接方法采用标准的II型限制性内切酶 (限制酶) (例如 Eco RI) 切割DNA，这些限制酶通常识别4~8 bp的回文序列，并在识别序列内部切割产生粘性末端或平末端 (图1A)。而Golden Gate Assembly采用IIS型限制酶 (例如 Bsa I) 切割DNA，这些限制酶识别非回文序列，并在识别序列外部切割产生粘性末端 (图1B)。【图1】II型限制酶和IIS型限制酶切割DNA IIS型限制酶切割DNA产生的粘性末端通常为2个碱基或4个碱基。在连接反应中，粘性末端的碱基数越多，连接产物的保真度越高，因此Golden Gate Assembly通常采用能够产生4碱基粘性末端的IIS限制酶，常用的有 Bsa I、 Bsm BI和 Bbs I (图2) 。NEB公司对这三种野生型的限制酶进行了分子改造，得到三种识别序列不变但特异性更强的限制酶，分别是 Bsa I-HFv2、 Bsm BI-v2和 Bbs I-HF (图2) 。这些限制酶的识别序列长度都是6 bp，因此在DNA序列中出现的概率都是1/4096。【图2】三种IIS型限制酶的特异性如图2所示，三种IIS型限制酶的特异性可分别记为： Bsa I (GGTCTC 1/5), Bsm BI (CGTCTC 1/5), Bbs I (GAAGAC 2/6) 。除此之外，能够产生3碱基粘性末端的IIS型限制酶 Sap I (GCTCTTC 1/4) 也常被使用 [3]，这个限制酶虽然产生的粘性末端更短，导致连接产物的保真度会略有降低，但是识别序列长度更长 (为7 bp)，因此在DNA序列中出现的概率是1/16384。根据切割位点序列的不同， Bsa I、 Bsm BI和 Bbs I可以产生的粘性末端有256种， Sap I可以产生的粘性末端有64种。市面上有许多基于Golden Gate Assembly的克隆试剂盒，不过价格都很贵，我一向建议大家自己买酶和试剂配制反应体系，只要弄懂Golden Gate Assembly的工作原理和实验设计方法就没有问题。下面我以 Bsa I-HFv2为例，讲讲如何使用Golden Gate Assembly构建质粒。设计引物通过PCR引入 Bsa I的识别序列，识别序列加在引物的5'端，为了确保限制酶能稳定结合到DNA双链上并发挥切割作用，需在识别序列末端加上保护碱基。保护碱基的数量和种类不是固定的，为了简化引物设计，大家可以用TTT作为保护碱基(3 bp的保护碱基对于绝大多数限制酶来说是足够的，若是为了保险起见，也可将保护碱基增加至6 bp。由于切割位点在识别序列的下游且可以是任意序列，因此有3种不同的引物设计方法，如图3所示。【图3】设计引物的三种策略：N代表任意碱基, 1234和5678代表两个不同的切割位点, N和切割位点既可以利用PCR模板现有的序列，也可以通过引物引入实验原理 (1) 2个DNA片段的连接【图4】Golden Gate Assembly连接两个片段 (2) 4个DNA片段的连接【图5】Golden Gate Assembly连接四个片段：1234, 5678, abcd和efgh代表四个不同的切割位点上面两个图分别展示了2个片段连接和4个片段连接的工作原理，其他数量片段的连接类似。酶切和连接是在同一个反应体系中进行的，可以用PCR产物作为底物 (如图4和图5)，也可以先将PCR产物分别克隆到质粒载体上，再用质粒作为底物。在合适的实验条件和实验设计下，利用Golden Gate Assembly可以组装超过20个DNA片段。下面这个小视频可以帮助大家进一步理解Golden Gate Assembly的工作原理。 Golden Gate Assembly的工作原理操作流程 (1) 配制反应体系 ① 每个插入片段的加入量可根据载体的加入量与载体和插入片段的长度进行换算，这里提供一个换算工具 !/ligation; ②其他可用的内切酶：BsmBI-v2(NEB #R0739, 10U/µl), BbsI-HF (NEB #3539, 10U/µl), SapI (NEB #R0569,10U/µl); ③若插入片段数量为1~10，则用10 units；若插入片段数量大于10，则用20 units; ④ 若插入片段数量为1~10，则用500 units；若插入片段数量大于10，则用1000units。 (2) 反应程序注: 37℃是BsaI-HFv2的最适反应温度，若使用其他限制酶，该温度可能需要调整，比如BsmBI-v2的最适温度为42℃。优点与传统的酶切连接比较 (1) IIS型限制酶的切割位点在识别序列外部，因此识别序列在酶切过程中被除去，不会在连接产物中引入不必要的序列。 (2) IIS型限制酶对切割位点的序列没有要求，因此可以通过设计切割位点的序列产生不同的粘性末端，使得多片段定向组装成为可能。 (3) 由于识别序列不会残留在连接产物中，因此酶切反应和连接反应可以在同一个反应体系中进行，简化了实验流程。与Gibson Assembly比较 (1) 片段连接过程中不涉及序列的降解和合成，因此连接产物的保真度更高。 (2) 可以组装的DNA片段数量更多，适用于质粒建库。 (3) 可以组装带有同源序列或重复序列的DNA片段，比如可用于构建表达多个sgRNA的质粒 [4]。 (4) 可以构建标准化的合成生物学元件，这一点类似于和BioBricks。注意事项 (1) 需选用合适的限制酶，该限制酶的识别序列在最终的连接产物中不能出现。 (2) 设计引物时，识别序列和切割位点的取向要正确。 (3) 当插入片段的数量较多时，为了确保连接的特异性，需要合理设计切割位点的4 bp序列。参考文献[5] 的Table S7提供了优化的切割位点序列组合另外，NEB公司提供的Golden Gate Assembly Tool可以帮助大家设计引物 NEB Golden 参考文献： [1] Engler, C., et al. (2008) PLoS One 3, e3647. A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput [2] Engler, C.,et al.(2009) PLoS One 4, e5553. Golden Gate Shuffling: A One-Pot DNA Shuffling Method Based on Type IIs Restriction [3] Whitman, L., et al. (2013) Genet. Eng. Biotechnol. 33, 42. (PDF) Rapid, Scarless Cloning of Gene Fragments Using the Electra Vector [4] Vad-Nielsen, J., et al. (2016) Cell Mol. Life Sci. 73, 4315–4325. [5] HamediRad, M., et al. (2019) ACS Synth. Biol. 8, 1047–1054. Highly Efficient Single-Pot Scarless Golden Gate

一、克隆技术的科学意义及经济价值克隆技术的突破,首先标志着人类对生命的认识水平与改造能力的提高,这本身是人类文明的长足进步。作为生物工程的一项重要成果,克隆技术为解决某些日益尖锐的问题和矛盾提供了多种可能的途径和方法。 (一)克隆技术给医学领域带来美好应用前景。在人类基因组的带动下,人们正在进行治疗性克隆试验,旨在生产克隆的或单性生殖的人类胚胎以获取干细胞,为人类研究癌症、艾滋病、老年痴呆、帕金森氏症等疑难病症,从基因层面揭示疾病产生的分子生物学机制,预报人体的机能和病理变化,找到标本兼治的治疗方法。克隆生物工程技术将克服中西药的弊端,将使医学在21世纪发生革命性的变化。治疗性克隆和干细胞研究为人体缺失器官的修复和重建带来希望,不但能治疗或预防器官功能衰竭,而且能防治衰老,解决目前我们面临的寿命延长而生命质量低下的难题。寿终无年、青春常驻的梦想在21世纪有可能会逐步成为现实。 (二)克隆技术有助于加速动植物育种过程。作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破,克隆技术反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步,为挽救濒临灭绝物种提供了多种可能和广阔的发展前景。利用优良动物品种的体细胞提供细胞核来克隆动物,可以避免自然条件下育种所受到的动物生育周期和生育效率的限制,缩短育种年限,提高育种效率,按照自己的意愿创造出有更高经济价值的动物新品种来;可以再现物种,保护和拯救濒危动物。同时,运用克隆技术可以超越自然节奏,主动调控生物链及生态环境,减少环境污染,保护地球这一万物共有的家园。 (三)克隆技术将引起制药业和农业生产的革命。利用体细胞克隆技术使外源基因整合到受体细胞中并稳定地遗传到子代,可以用来大量繁殖许多有价值的基因,直接生产出人类适用的医药用蛋白等高效药物。如治疗糖尿病的胰岛素、有希望使侏儒患者重新长高的生长激素和能抗多种疾病感染的干扰素等。克隆山绵羊将会出现人类新的制药厂,生产人类健康需求的应有尽有的药用动物或动物药。据计算,一头转基因山羊一年提供的人凝血因子LX活性蛋白相当于上海全年献血总量所含同类蛋白的总和。人们一旦突破克隆生物技术,就能改变农作物的基因型,产生大量抗病、抗虫、抗盐碱和遗传性质稳定的新品种,培育动物的优良品种,培育生产奶量高,奶中富含人体所需营养物质的乳牛,以满足人体对营养的需求。二、克隆技术的负面作用与问题思考科学技术是一把双刃剑,它对于社会的作用是双重的,克隆技术也不例外。克隆技术的发展伴随着对伦理道德的影响的冲击,其负面作用不容忽视。自“多莉”羊诞生以来,关于克隆技术的争论日渐激烈。克隆技术的迅速发展,不仅为自然科学领域瞩目,也受到了社会科学领域的科学家的关注。因为,一旦这一技术被应用于人类自身,既克隆人的产生,那将是对人类社会伦理道德的一项严峻挑战。克隆人可能对社会道德、社会伦理产生不可预料的负面影响:第一,它危害了伦理学的不伤害原则。从“多莉”羊的实例可以看出克隆动物的成功率很低,如果在人身上做成功率可能更低,而且很可能会产生出许多畸形的、具有严重缺陷的克隆人,自然会造成对他们的伤害;第二,克隆人违背了伦理学的自主原则。被克隆者作为人所享有的独特性被粗暴的剥夺了;第三,克隆人违背了伦理学的平等原则。克隆人也是人,我们不能将他们仅仅当作为他人的目的服务的手段和工具。对克隆技术持否定态度的人看到了克隆人可能引发的一系列社会、伦理、法律等问题。从政治角度看,克隆人的出现可能使人类自身的安全受到威胁;从经济角度看,克隆人可能使人的生产劳动发生畸形分化,如让克隆人当奴仆以及作为人的工具;从人类学和社会学角度看,克隆人与供体者的关系将是社会不稳定的潜在因素;从法学角度看,克隆人将给法治社会制造不易化解的困境;从心理学角度看,克隆人有难以逾越的心理障碍;从进化论角度看,克隆人不利于人类的进化;从哲学角度看,克隆人消除人的个性,破坏人类的多样性。在克隆人可能引发的社会性问题中,最大量、最复杂的恐怕还是道德伦理问题。从社会伦理角度看,克隆人对人类发展的干预会影响人种的自然构成和自然发展。克隆人的出现将使两性结合繁殖后代的传统生殖模式被打破、人伦关系模糊以及人口性别比例失调,甚至可能被别有用心的人利用制造人类灾难;从家庭伦理角度看,克隆技术用于人体繁殖,会加剧家庭多元化趋向,还会从根本上改变人的亲系关系,确定人类亲系关系的标准也将发生改变;从性伦理学角度看,它完全改变了人类自然的、基于性爱的生育方式,使人口的生产与性爱分离,破坏人类的情感;从生命伦理学角度看,它破坏了人拥有独特基因的权利,有可能导致人种的退化,还会使正常的生与死的概念发生动摇。

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我们所说的生物技术的利和弊主要指的是克隆，其利和弊是利:1)克隆技术可解除那些不能成为母亲的女性的痛苦。2)克隆实验的实施促进了遗传学的发展，为“制造”能移植于人体的动物器官开辟了前景。3)克隆技术也可用于检测胎儿的遗传缺陷。将受精卵克隆用于检测各种遗传疾病，克隆的胚胎与子宫中发育的胎儿遗传特征完全相同。4)克隆技术可用于治疗神经系统的损伤。成年人的神经组织没有再生能力，但干细胞可以修复神经系统损伤。5)在体外受精手术中，医生常常需要将多个受精卵植入子宫，以从中筛选一个进入妊娠阶段。但许多女性只能提供一个卵子用于受精。通过克隆可以很好地解决这一问题。这个卵细胞可以克隆成为多个用于受精，从而大大提高妊娠成功率。弊:1)克隆将减少遗传变异，通过克隆产生的个体具有同样的遗传基因，同样的疾病敏感性，一种疾病就可以毁灭整个由克隆产生的群体。可以设想，如果一个国家的牛群都是同一个克隆产物，一种并不严重的病毒就可能毁灭全国的畜牧业。2)克隆技术的使用将使人们倾向于大量繁殖现有种群中最有利用价值的个体，而不是按自然规律促进整个种群的优胜劣汰。从这个意义上说，克隆技术干扰了自然进化过程.3)克隆技术是一种昂贵的技术，需要大量的金钱和生物专业人士的参与，失败率非常高。多莉就是277次实验唯一的成果。虽然现在发展出了更先进的技术，成功率也只能达到2-3%。4)转基因动物提高了疾病传染的风险。例如，如果一头生产药物牛奶的牛感染了病毒，这种病毒就可能通过牛奶感染病人5)克隆技术应用于人体将导致对后代遗传性状的人工控制。克隆技术引起争论的核心就是能否允许对发育初期的人类胚胎进行遗传操作。这是很多伦理学家所不能接受的。6)克隆技术也可用来创造“超人”，或拥有健壮的体格却智力低下的人。而且，如果克隆技术能够在人类中有效运用，男性也就失去了遗传上的意义。7)克隆技术对家庭关系带来的影响也将是巨大的。一个由父亲的DNA克隆生成的孩子可以看作父亲的双胞胎兄弟，只不过延迟了几十年出生而已。很难设想，当一个人发现自己只不过是另外一个人的完全复制品，他（或她）会有什么感受？所以说,科学技术有时就是一把双刃剑,有利也有没弊,没有标准答案!就看人们这样利用了

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克隆技术的利 1．克隆技术与遗传育种在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2．克隆技术与濒危生物保护克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3．克隆技术与医学在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。克隆技术的弊在理论上，克隆技术还很不成熟；在实践中，克隆动物的成功率还很低，生出的部分个体表现出生理或免疫缺陷，而且动物的残废率相当高并伴有早衰现象等。此外，克隆技术（尤其是人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对词的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。我认为，克隆技术的巨大理论意义和实用价值在于它促使科学家们加快了研究的步伐，使克隆技术的研究与开发进入一个高潮，从而更好地为人类造福。关于人的：目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。然而，克隆技术也存在着一些弊端。在理论上，克隆技术还很不成熟；在实践中，克隆动物的成功率还很低，生出的部分个体表现出生理或免疫缺陷，而且动物的残废率相当高并伴有早衰现象等。此外，克隆技术（尤其是人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对词的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。我认为，克隆技术的巨大理论意义和实用价值在于它促使科学家们加快了研究的步伐，使克隆技术的研究与开发进入一个高潮，从而更好地为人类造一是生态层面，克隆技术导致的基因复制，会威胁基因多样性的保持，生物的演化将出现一个逆向的颠倒过程，即由复杂走向简单，这对生物的生存是极为不利的。二是文化层面，克隆人是对自然生殖的替代和否定，打破了生物演进的自律性，带有典型的反自然性质。与当今正在兴起的祟尚天人合一、回归自然的基本文化趋向相悖。三是哲学层面，通过克隆技术实现人的自我复制和自我再现之后，可能导致人的身心关系的紊乱。人的不可重复性和不可替代性的个性规定因大量复制而丧失了唯一性，丧失了自我及其个性特征的自然基础和生物学前提。一是血缘生育构成了社会结构和社会关系。为什么不同的国家、不同的种族几乎都反对克隆人，原因就是这是另一种生育模式，现在单亲家庭子女教育问题备受关注，就是关注一个情感培育问题，人的成长是在两性繁殖、双亲抚育的状态下完成的，几千年来一直如此，克隆人的出现，社会该如何应对，克隆人与被克隆人的关系到底该是什么呢?二是身份和社会权利难以分辨。假如有一天，突然有20个儿子来分你的财产，他们的指纹、基因都一样，该咋办?是不是要像汽车挂牌照一样在他们额头上刻上克隆人川A0001、克隆人川A0002之类的标记才能识别。第三，支持克隆人的人有一个观点：解决无法生育的问题。但一个没有生育能力的人克隆的下一代还会没有生育能力。你自认为优秀，可克隆出的人除血型、相貌、指纹、基因和你一样外，其性格、行为可能完全不同，你能保证克隆人会和你一样优秀而不误入歧途吗?在克隆人研究中，如果出现异常，有缺陷的克隆人不能像克隆的动物随意处理掉，这也是一个麻烦。因此在目前的环境下，不仅是观念、制度，包括整个社会结构都不知道怎么来接纳克隆人。” 克隆技术在短期内会造福人类，但是终将给人类带来灾难。造福体现在器官培养，可以救治肢残或患其它疾病者；并且可以复制出去世亲人体现哀思。但是克隆技术如果用于复制人，就是人类精神和物质上的双重灾难，精神上人类的伦理道德将被破坏，身体上克隆技术具有未知的问题，可能会引起几代后的人的基因变异。更严重的是长大后的基因人也是人，也受法律保护，他们自由婚恋的权力必将受宪法保护，他们的后代将混入人群，如果若干代后从社会学角度，将会将克隆人的基因传至全世界，一旦发生未知变化，人类将面临灭亡。好处：可以治病救人

分类: 教育/科学 >> 学习帮助解析: 克隆技术发展十分迅速。各国 *** 有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。然而，克隆技术也存在着一些弊端。在理论上，克隆技术还很不成熟；在实践中，克隆动物的成功率还很低，生出的部分个体表现出生理或免疫缺陷，而且动物的残废率相当高并伴有早衰现象等。此外，克隆技术（尤其是人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对词的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。我认为，克隆技术的巨大理论意义和实用价值在于它促使科学家们加快了研究的步伐，使克隆技术的研究与开发进入一个 *** ，从而更好地为人类造福。

克隆技术的文章有参考文献

1．克隆技术与遗传育种在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2．克隆技术与濒危生物保护克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3．克隆技术与医学在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。（如果我的回答能够解决你的问题，请采纳，谢谢……！！！）

弊:1) 克隆将减少遗传变异,通过克隆产生的个体具有同样的遗传基因,同样的疾病敏感性,一种疾病就可以毁灭整个由克隆产生的群体.可以设想,如果一个国家的牛群都是同一个克隆产物,一种并不严重的病毒就可能毁灭全国的畜牧业.2) 克隆技术的使用将使人们倾向于大量繁殖现有种群中最有利用价值的个体,而不是按自然规律促进整个种群的优胜劣汰.从这个意义上说,克隆技术干扰了自然进化过程.3) 克隆技术是一种昂贵的技术,需要大量的金钱和生物专业人士的参与,失败率非常高.多莉就是277次实验唯一的成果.虽然现在发展出了更先进的技术,成功率也只能达到2-3%.4) 转基因动物提高了疾病传染的风险.例如,如果一头生产药物牛奶的牛感染了病毒,这种病毒就可能通过牛奶感染病人 5) 克隆技术应用于人体将导致对后代遗传性状的人工控制.克隆技术引起争论的核心就是能否允许对发育初期的人类胚胎进行遗传操作.这是很多伦理学家所不能接受的.6) 克隆技术也可用来创造“超人”,或拥有健壮的体格却智力低下的人.而且,如果克隆技术能够在人类中有效运用,男性也就失去了遗传上的意义.

关于克隆的资料克隆是英文clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后，再被植入动物子宫中使动物怀孕，便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。克隆技术研究现状一、克隆的早期研究克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。三、近3年来克隆研究的重要成果克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。 1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。 2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。四、克隆技术的应用前景克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998，Science），而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。五、克隆技术存在的问题尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟，在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。在实践中，克隆动物的成功率还很低，维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有％和％，即使是使用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。此外，生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战，美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月，英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告，表明英国政府将重新考虑这一决定，认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举，关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。回答者：督☆督 - 试用期一级 3-7 20:59一、克隆的概念众所周知，生物的繁衍是通过生殖完成的。生物的繁殖有两种方式：一种叫有性生殖，一种叫无性生殖。有性生殖是通过两性生殖细胞 ( 精子和卵子 ) 的融合，并发育形成后代的生殖方式。无性生殖则不经过两性生殖细胞的结合，而是由生物体自身的分裂生殖或其体细胞生长发育形成个体。无性生殖多见于植物与某些动物 ( 如单细胞动物与低等动物 ) 。克隆是英文“ clone ”的音译，来自希腊文 klon ，原意为苗或嫩枝，指以无性生殖或营养生殖的一些植物。随着时间的推移和科学的发展，它的含义增加了许多内容，如一个细胞在体外培养下产生的一群细胞；由“亲本”序列产生的 DNA 序列等等。概言之，克隆是指由一个细胞或个体，通过无性繁殖手段，获得遗传上相同的细胞群或个体群。我国古典名著《西游记》里的孙悟空，只要拔撮毫毛吹口仙气，就能“变”出许多孙悟空。因为拔一撮毫毛必须带下一群细胞，这一群细胞就能培养出一群相同的孙大圣。这也归属于无性生殖。只不过孙大圣本领高强，能在瞬间“克隆”出千百个自己而已。简而言之，克隆就是无性生殖，就是“复制”、“翻版”。二、植物的克隆无性生殖 ( 克隆 ) 本来是一种低级的生殖方式。生物进化的层次越低，越有可能采取这种生殖方式，进化层次越高，则越不可能采取这种生殖方式。由于低级生物，如微生物，采取自行分裂的方法繁殖，分裂后子代与亲代的遗传物质完全一样，因此在这个意义上微生物没有“个体”，它们也没有死亡。虽然在严格的意义上，微生物的亲代与子代仍然会有若干差异，因为它们的外界营养环境仍然会有差异，但从高等动物的角度看，这种差异似乎太微不足道了。在这种差异可以不计的条件下，人们可以说，对微生物来说，它们是不死的。死亡是生物进化到较高阶段的产物。现在生物医学研究中用克隆技术在体外培养的正常细胞或癌细胞，也称为“永生细胞株”，意思也是说这些细胞是“不死的”。生物医学研究进入微观层次，运用克隆技术来培养正常或异常细胞的永生细胞株，虽然是一件难度很大的工作，但已经在各国的科学界和医学界越来越得到重视。在农业上，人们早已用插枝、压条等方法，来繁殖适合于人类需要的植物。在畜牧业上，各国都在进行用克隆技术产生更多良种动物的研究。但从高等生物成体的体细胞中发育出一个成体，这是克隆技术的一个重大发展。早在许多年前，美国康奈尔大学研究人员将成熟的胡萝卜高速搅拌，获得单个胡萝卜细胞，然后将这些单个细胞置于生长培养基中，培养出遗传上完全一样的胡萝卜。这个试验证实了植物细胞全能性学说。所谓植物细胞全能性学说是指植物体的每一个细胞，包括体细胞，都具有发育成完整个体的潜能。植物细胞全能性学说在植物界已经得到广泛的证明。现在我们可以植物体的任何一种活的细胞、组织、器官，经过体外人工培养获得它的完整植株，并产生许多植物。这种技术被称为组织培养。它已用于工厂化生产花卉、作物 ( 如甘蔗 ) 的试管苗。三、动物克隆的历程关于动物的无性生殖研究，一直是科学家探索的课题。因为人类通过有性生殖的方法，选育家畜品种已有上千年的历史，结果是产生了一些优良的个体或群体。它们比一般的个体更能满足人们的需要和愿望。譬如，一头产奶量特别高的奶牛，一群毛产量多的绵羊，一匹得奖的赛马或一只优秀的警犬。可是，有性生殖的后代，其性能不一定都同亲代一样，有的甚至不如亲代。究其原因，因为卵子或精子只携带构成亲代的、任意一半的等位基因，而等位基因几乎可以有无限的组合，因而会产生不同的后代。兄弟、姊妹、兄妹、姊弟之间都有很大的差异，便是因为极难有完全相同的基因型。所以通过有性生殖保持一种表现型是非常困难的。如果获得一种理想的表现型如产奶量高的奶牛，再通过无性生殖保持、扩大和繁殖这种表现型，即生产许多遗传上相同的个体，从经济角度讲显然是很有价值的。 ⒈卵细胞培养成成体 1951 ～ 1959 年，我国著名细胞生物学家朱冼等，用直径 10 ～ 13um 的玻璃针刺激去卵膜的蟾蜍卵细胞，在世界上首次培养出 25 只蟾蜍成体，即没有父亲的癞蛤蟆。它们最长的可活 8 个月。在上述试验中用的是生殖细胞。体细胞能否通过培养获得动物体呢？即植物细胞具有的全能性，动物细胞是否也具有？每个动物细胞，包括体细胞都具有该物种的全套基因是不容怀疑的，但从体细胞直接培养成动物成体至今尚未成功。为了证明动物细胞也具有全能性，生物学家进行了大量的细胞核移植试验。 ⒉细胞核移植试验 1939 年，科学家首次在变形虫中进行核移植试验。他们将核移到同种去核变形虫中，结果重组的变形虫可生长，并繁殖后代。 1963 年起，我国著名生物学家童第周等进行了大量的鱼类核移植试验。其中 1980 年，他们将鲤鱼囊胚期细胞核作供体核，鲫鱼的未受精去核成熟卵细胞作受体质，的移核卵发育到成鱼。鲤鲫移核鱼的主要性状与鲤鱼相同，但脊椎骨的数目与鲫鱼相同，而侧鳞的数目介于这两种鱼之间。这种细胞工程鱼生长速度比鲤鱼快 22% ，现已在生产上大面积推广。 1966 年，科学家用两栖类非洲爪蟾进行核移植试验。他们将蝌蚪的肠细胞的细胞核移入去核的卵细胞中，结果有的重组细胞发育成体。他们的试验第一次证明了动物的体细胞也具有全能性，但在哺乳动物体细胞中尚未证明。 ⒊用胚胎细胞克隆哺乳动物 1986 年，英国科学家用绵羊的 8 细胞胚胎细胞 ( 在 8 细胞胚胎之前的细胞才能表现全能性 ) 做供核细胞，羊的卵细胞做供质细胞，结果重组细胞能发育成羊成体，此后又相继用胚胎细胞克隆出牛、鼠、兔、猴等动物。应该指出的是，该试验并非复制雄性或雌性绵羊，而是复制它们的后代，因此试验还存在一定的不足或缺陷。在我国，用胚胎细胞克隆哺乳动物， 80 年代末已克隆出免； 1991 年西北农业大学和江苏农学院克隆出羊； 1993 年中国科学院发育研究所与扬州大学农学院克隆出山羊； 1995 年华南师大和广西农业大学克隆出牛。此外，湖南医学院还克隆出鼠。但是，用胚胎细胞以外的体细胞克隆出哺乳动物，则是由英国科学家维尔穆特开创的。四、“多莉”的诞生 “多莉”是世界上第一例用体细胞——乳腺上皮细胞，通过细胞核移植技术，在复杂的人工操作下，得到的一只小绵羊。其操作过程是这样的： ⒈从苏格兰黑脸母羊 ( 甲羊 ) 取出卵子，并把卵子的遗传物质吸去，成为只有细胞质的卵子。 ⒉从妊娠后期 3 个月的母羊 ( 乙羊 ) 取出乳腺上皮细胞，在体外传代培养 3 — 6 代，并用药物处理控制细胞发育使之处于休止期。这是非常关键的一步。然后取休止期的细胞作为供体细胞。 ⒊将一个供体细胞导入上述卵子的透明带内腔。然后用电脉冲刺激，使供体细胞和卵子融合，形成重构卵。 ⒋把重构卵移植到黑脸母羊 ( 羊丙 ) 的输卵管里，此前将丙羊的输卵管结扎，使胚胎不能进入子宫。丙羊起到活体培养胚胎的作用，称为中间受体。 ⒌重构卵移入丙羊输卵管内 6 天后，从输卵管冲出胚胎，挑选正常发育到桑椹期和囊胚期的胚胎。 ⒍将 1 — 3 个桑椹胚或囊胚，移植到苏格兰黑脸羊 ( 丁羊 ) 的子宫内。胚胎移植到子宫后 , 继续发育 , 最后生出“多莉”。这只母羊称为“代母”。此项用了约 434 个卵子 , 获得 277 个重构卵 , 移植到中间受体 6 天后，冲出 247 个胚胎 , 其中发育到桑椹胚和囊胚的 29 个 () 。把 29 个胚胎移植给 13 只代母，最后生出 1 只“多莉” , 产羔率仅为。若以重构卵数计算 , 产羔率低于 4 ‰。可见这一技术有待于完善。另外需要说明的是，克隆绵羊技术并没有做到完全复制，去核卵细胞的细胞质也会含有少量遗传物质，它对胚胎发育也能起重要甚至是决定性的作用。生物的遗传是细胞核和细胞质共同作用的结果。细胞质基因也是 DNA 片段 , 其载体主要是一些细胞器，如质体、线粒体等。细胞质基因在一定程度上是独立的，一般不受核基因的干扰。与核基因相比尽管细胞核含有的遗传信息，但个体的性状表达仍然会受到卵细胞质的影响。因此，从理论上分析，“多莉”羊还不是完全复制品。由于“多莉”只是孤单的一个，所以有人认为，说“多莉”是一克隆动物，并不准确。虽然目前只获得 1 只“多莉”，但它是令世人瞩目的重大科学成就。五、克隆技术的意义及经济价值波澜壮阔的人类历史在很大程度上是由技术推动发展的：金属制造和改良的农业使文明脱离了石器时代； 19 世纪的工业革命又导致了大机器和大城市的兴起；到了 20 世纪，物理学戴上了王冠。物理学家们劈开原子，揭示了相对论和量子理论的奇妙世界，还开发利用了小小的硅片。他们通过原子弹、晶体管、激光和微型集成电路改变了世界。现在，许多专家相信，人类已经做好了用新的科技发展浪潮迎接未来的准备。正如 1996 年诺贝尔奖获得者、美国赖斯大学的化学家罗伯特·柯尔所说：“现在是物理学和化学的世纪，但下世纪显然将是生物学的世纪。”许多科学家认为，以克隆绵羊“多莉”诞生为标志，生物学世纪已经提前到来。克隆技术的突破，引起世人的震惊。人们担心的是人类的自我复制，而往往忽视了其他方面的应用和意义。其实，它在基础生命科学、医学、家业科学研究与生产中，具有重大的理论价值和广泛的应用前景，并存在着巨大的潜在经济效益。在未来的 5 ～ 20 年，将逐步形成和引起一场世界范围内新的生物技术产业革命。 ⒈在基础生命科学方面，由以往进行基因功能研究主要在小鼠等少数动物身上进行到现在在多种动物身上均可得到实现，这有利于更加清晰地揭示基因功能和生命的本质；提供研究哺乳动物细胞发育全能性及核质关系最有效的手段之一；还可以克隆各种濒危动物，如国宝大熊猫、金丝猴甚至白鳍豚等。 ⒉在医学科学方面，可以为医学科学研究提供核基因型完全一致的实验动物，这有利于医学家研究目前尚未找到有效治疗方法的疾病，并揭示发病机制；对其进行去分化机制的研究，有助于抗衰老及其机制的研究。 ⒊在农业科学方面，可快速培育和扩繁抗病力强、生产性能高的优良动物；可以研究动物的发病机理，寻求新的有效治疗药物。六、如何迎接“克隆时代”的挑战克隆技术的成功，标志着“复制”哺乳动物的最后技术障碍已被突破。随之而来，在理论上复制人类已成为可能。所以，克隆技术不仅给我们带来了益处，也向人类提出了严峻的挑战。这一技术一旦应用于人类，将会对人类社会产生极其严重的后果。 ⒈人类从有性生殖回到了无性生殖，